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犬萊姆病間接ELISA診斷方法的建立與應用

時間:2020-01-07 來源:吉林大學 作者:楊瑩瑩 本文字數:8850字
  摘要
  
  犬萊姆病診斷方法的建立及應用
  
  萊姆。↙yme disease)是由媒介蜱傳播的伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferisensu lato)感染所引起的一種自然疫源性疾病,是由蟲媒介蜱傳播的人獸共患病,該病發生和流行的時間與蜱蟲活躍時間一致。萊姆病對人類、動物的健康構成了嚴重的危害,主要波及野生動物及寵物的健康養殖,已成為全球嚴峻的公共衛生問題。1986年,自艾承緒等首次在黑龍江省海林縣發現本病以來,我國目前已有30個。ㄊ、區)經確認為萊姆病自然疫源地,主要分布在華北、西北和東北林區,分布呈現地域聚集的趨勢,該病的發生依賴于其媒介蜱以及宿主動物的分布,但由于蜱蟲叮咬時無痛感,且該病的早期癥狀不明顯,常與風濕性關節炎等疾病、發燒等現象混淆導致錯過最佳治療時間。早在1993年,于美國紐約25個城鎮采集的1446份犬血液樣本中,犬萊姆病陽性率介于6.5%至85.2%之間。該數據表明由于人類與寵物犬關系密切,導致人感染萊姆病的機率增加。隨著我國經濟快速發展與人民生活水平的提高,寵物逐漸成為了人們生活中不可或缺的一部分。然而,我國對于犬萊姆病的血清學檢測方法尚未報道,因此建立快速準確的犬萊姆病診斷方法迫在眉睫。本研究在國家十三五重點研發項目“寵物細菌與真菌傳染病診療與防控新技術研究”(項目編號:2016YFD0501005)支持下,建立伯氏疏螺旋體SYBR Green I熒光定量PCR方法和犬萊姆病間接ELISA診斷方法,為寵物與人類的健康安全提供技術支持與保障。主要研究內容如下:

犬萊姆病間接ELISA診斷方法的建立與應用
  
  I. 伯氏疏螺旋體SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法的建立本研究基于國內外主要流行的伯氏疏螺旋體菌株的3個基因型:嘎氏疏螺旋體(B. garinii)、阿氏疏螺旋體(B. afzelii)、狹義伯氏疏螺旋體(B. burgdorferi sensustricto)中的16S  r RNA基因片段為模板,針對伯氏疏螺旋體的保守區域設計Real-time  PCR特異性引物,建立熒光定量方法。其中該方法標準曲線的相對系數R2為0.99,擴增效率為98.217%。特異性試驗結果表明,所建立的方法只特異的檢測出伯氏疏螺旋體,而與其它病原無交叉反應。敏感性試驗結果表明此方法比普通PCR靈敏104倍,能夠檢測到的最小拷貝數為4.72  copies/μL。應用該方法對采自吉林省四平市的25只蜱蟲樣本進行檢測,樣品陽性率為40.00%。
  
  II. 伯氏疏螺旋體Osp C的克隆表達及抗原性分析選取伯氏疏螺旋體外膜蛋白C(Osp C),經過生物信息學分析,利用原核表達載體對B31菌株的Osp C基因進行表達、純化和Western-blot分析,表明該蛋白具有良好的免疫原性。
  
  III. 犬萊姆病間接ELISA診斷方法的建立與應用本研究建立了一種用于犬萊姆病診斷和血清流行病學調查的ELISA方法。
  
  以Osp C蛋白為包被抗原,建立了用于犬萊姆病抗體檢測的間接ELISA方法。應用該方法對所采集到的309份犬血清臨床樣品進行應用檢測,平均抗體陽性率達20.71%。結果表明本研究所建立的ELISA方法可用于臨床血清樣本的檢測,檢測結果說明萊姆病在我國的犬群中感染率較高。
  
  關鍵詞: 萊姆病,伯氏疏螺旋體,SYBR Green I熒光定量PCR,間接ELISA 。
  
  Abstract
  
  Establishment and Application of Diagnosis Method for   Canine Lyme Disease
  
  Lyme  disease  is  a  natural  epidemic  disease  caused  by  Borrelia  burgdorferi infection  transmitted  by  vector  ticks.  It  is  a  zoonosis  transmitted  by  vector  vectors. The occurrence and prevalence of Lyme disease is the same as the active time of ticks. Lyme  disease  poses  a  serious  hazard  to  the  health  of  humans  and  animals.  It  mainly affects the healthy breeding of wild animals and pets and has become a serious public health problem in the world. In 1986, since Ai Chengxu first discovered the disease in Hailin  County  of  Heilongjiang  Province,  there  are  currently  30  provinces  (cities  and districts) in China that have been identified as natural sources of Lyme disease. Lyme disease is mainly distributed in north, northwest and northeast forest regions in China. The  distribution  shows  a  tendency  of  regional  aggregation.  The  occurrence  of  the disease depends on the media and the distribution of host animals. However, because the  locust  is  not  painful  when  bitten,  and  the  early  symptoms  of  the  disease  are  not obvious,  often  confused  with  rheumatoid  arthritis  and  other  diseases,  fever,  etc., leading to missed the best treatment time. As early as 1993, the Lyme disease rate was between 6.5% and 85.2% in 1446 canine blood samples collected from 25 cities and towns  in  New  York.  This  data  shows  that  due  to  the  close  relationship  between humans  and  pet  dogs,  the  chance  of  people  being  infected  with  Lyme  disease increases. With the rapid economic development of our country and the improvement of  people’s  living  standards,  pets  have  gradually  become  an  integral  part  of  people’s lives.  However,  the  serological  detection  methods  for  canine  Lyme  disease  in  China have  not  been  reported.  Therefore,  it  is  urgent  to  establish  a  rapid  and  accurate diagnosis  method  for  Lyme  disease  in  canines.  This  research  was  supported  by  the National  Thirteenth  Five-Year  Key  Research  and  Development  Project  “Studies  on New  Technologies  for  the  Diagnosis,  Treatment,  Prevention,  and  Control  of  Pet Bacterial  and  Fungal  Infections”  (Project  Number:  2016YFD0501005).  The establishment  of  SYBR  Green  I  fluorescence  quantitative  PCR  method  and  canine Lyme  disease  indirect  ELISA  diagnosis  method  provide  technical  support  and protection  for  pets  and  human  health  and  safety.  The  main  research  content  is  as follows:
  
  I.Establishment of SYBR Green I Real-time PCR Assay for Detection of Borrelia burgdorferi This  study  was  based  on  the  three  genotypes  of  the  predominant  strains  ofBorrelia  burgdorferi  at  home  and  abroad:  the  16S  r RNA  gene  fragment  in  Borrelia garinii,  Borrelia  afzelii,  Borrelia  burgdorferi  sensu  stricto  as  a  template,  which  is conserved  against  Borrelia  burgdorferi.  Regional  design  of  Real-time  PCR  specific primers,  established  SYBR  Green  I  fluorescence  quantification  method.  The  relative coefficient  R2  of  the  fluorescence  quantitative  standard  curve  is  0.99,  and  the amplification  efficiency  is  98.217%.  The  specific  test  results  showed  that  the established  method  only  detected  B.  burgdorferi  specifically,  but  did  not  cross-react with other pathogens. Sensitivity test results show that this method is 104 times more sensitive  than  ordinary  PCR,  and  the  minimum  copy  number  that  can  be  detected  is 4.72 copies/μL. This method was applied to the detection of 25 tick samples collected from Siping City, Jilin Province. The positive rate of samples was 40.00%.
  
  II.Cloning  and  expression  of  Osp C  from  Borrelia  burgdorferi  and  antigenicity analysis Osp C  of  Borrelia  burgdorferi  was  selected.  After  bioinformatics  analysis,  the Osp C  gene  of  B31  strain  was  expressed,  purified  and  Western-blot  analyzed  using prokaryotic expression vector, indicating that the protein had good immunogenicity.
  
  III.Establishment and application of indirect ELISA for diagnosis of canine Lyme disease This  study  established  an  ELISA  method  for  diagnosis  of  canine  Lyme  disease and  serum  prevalence  investigations.  Osp C  protein  was  used  as  coating  antigen  to  establish an indirect ELISA for detection of Lyme disease in canines.This method was applied  to  the  clinical  samples  of  309  canine  serum  samples  collected.  The  average antibody  positive  rate  was  20.71%.  The  results  show  that  the  ELISA  method established in this study can be used for the detection of clinical serum samples. The test  results  show  that  the  infection  rate  of  Lyme  disease  is  high  in  the  canine population in China.
  
  Key words:  Lyme disease, Borrelia burgdorferi, Real-time PCR, Indirect ELISA 。
  
  第一篇  文獻綜述
  
  萊姆病(Lyme  disease,LD),是由螺旋體家族中的伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi  sensu  lato)經感染的蜱叮咬傳播給人和動物。1975年,一系列由媒介蜱傳播而引起的“少年紅斑性關節炎”在美國的康乃狄克州萊姆鎮引起了人們的重視[1]。7年后,由Willy  Burgdorferi首次在肩突硬蜱(Ixodes  scapularis)中分離到萊姆病的病原體伯氏疏螺旋體[2]。隨后,人們在萊姆病患者的關節滑液、腦脊液、血液、皮膚等組織也分離到伯氏疏螺旋體[3]。在中國,首次出現萊姆病的報道是在1986年,艾承緒在黑龍江省海林縣林區發現了萊姆病,并成功分離到伯氏疏螺旋體[4]。目前,已有30個地區都有過萊姆病的相關報道,這一現象表明萊姆病在我國的分布十分廣泛[5,6,7]。萊姆病在全世界范圍內流行較為廣泛,在美國尤為嚴重,又有“第二艾滋病”之稱,是一種全球性、對人類健康造成危害的一類蟲媒傳染病。該病已經成為我國相當重要的人獸共患病,應當給予高度重視。
  
  目前,人與人之間、動物與人之間傳播萊姆病報道較為罕見。萊姆病主要傳播途徑為蜱蟲叮咬,因此萊姆病的流行與蜱蟲的活動期息息相關,一年中的4至8月,尤其是5至6月初,是蜱蟲最為活躍的時間,因此預防萊姆病主要可以從預防蜱蟲叮咬做起。
  
  1、伯氏疏螺旋體病原學。
  
  伯氏疏螺旋體是革蘭氏陰性菌,屬于原核生物界、螺旋體目、螺旋體科、疏螺旋體屬[8]。單細胞疏松盤繞的左旋螺旋狀細菌運動方式主要以旋轉、扭曲和抖動為主,其細胞結構由原生質、鞭毛、外膜和表層組成。伯氏疏螺旋體長為10-20μm左右,寬0.18-0.25μm左右,通常有大而寬疏的螺旋4-20個,鞭毛位于外膜和胞漿膜之間,稱為軸鞭毛,伯氏疏螺旋體的特別之處是不含有脂多糖。伯氏疏螺旋體可以在BSK-H液體培養基中30-34℃中培養[9]。目前,伯氏疏螺旋體分為以下22種基因型:
  
  B. burgdorferi s.s、B. afzelii、B. garinii、B. lusitaniae、B.valaisiana、B. bissettii、B. andersonii、B. americana、B. tanukii、B. turdi、B. sinica、B.  chilensis、B.  californiensis、B.  japonica、B.  carolinensis、B.  finlandensis、B. bavariensis、B.  kurtenbachii、B.  yangtze、B.  spielmanii、B.  chilensis、B.hermsii[10,11,12]。其中已經報道具有致病性的有 8種,分別為:B. burgdorferi s.s、B.  afzelii、B.  garinii、B.  lusitaniae、B.  valaisiana、B.  bissettii、B.  americana、B.andersonii[13]。B. burgdorferi s.s主要在歐洲和北美洲流行,B. afzelii、B. garinii、B.  valaisiana和B.  lusitaniae主要在歐亞大陸之間流行,B.  turdi、B.  tanukii、B.japonica這三種主要在日本分布,B.  andersonii和B.  bissettii主要分布于北美洲[14,15]。我國主要分布的伯氏疏螺旋體有以下6種基因型:B.  burgdorferi  s.s 、B.garinii、B. afzelii、B. valaisiana、B. sinic和B. yangtze,其中最主要的為B. afzelii和B. garinii兩種基因型,B. afzelii主要分布于我國的南方和北方,B. burgdorferis.s、B. garinii則主要分布于我國的北方[16,17,18]。
  
  2、伯氏疏螺旋體生活史。
  
  伯氏疏螺旋體主要在宿主動物和蜱蟲中繁殖并傳播。伯氏疏螺旋體的感染譜很廣,主要包括脊椎動物,其中嚙齒類有:鼠類、兔子;大型的家畜和野生動物有:馬、牛、羊、犬、鹿等[19]。伯氏疏螺旋體在蜱蟲中不經卵垂直傳播,幼蜱在吸食被伯氏疏螺旋體感染了的宿主動物血液時,伯氏疏螺旋體隨著血液進入中腸,病原在中腸定居,直到幼蜱蛻皮完成;若蜱在吸食動物血液后,伯氏疏螺旋體會在若蜱中腸快速增值,隨后迅速的遷移至唾液腺。當蜱蟲再次叮咬宿主動物時,伯氏疏螺旋體會隨著唾液腺進入宿主體內,從而引發宿主感染[20,21]。研究表明,萊姆病病原在感染哺乳動物時,病原體會在叮咬部位停留12-48h,隨后在分散到不同的組織器官中[22]。
  
  3、萊姆病流行病學。
  
  萊姆病在全世界范圍內流行較為廣泛,目前在除北極以外的其它大陸均有流行報道,且發病區域逐漸擴大,發病率呈現出上升趨勢。研究發現該病成區域性流行,主要流行區域與硬蜱的生活范圍息息相關。美洲萊姆病疫源地主要分布在中西部及東北地區;歐洲主要分布于北歐及中歐地區[23,24];亞洲主要分布于中國和日本。目前我國30個省市自治區均有報道,其中有19個地區為萊姆病自然疫源地[25]。萊姆病在我國主要分布于東北、華北和西北部的林區地帶[26]。萊姆病的發病與蜱蟲的活動息息相關,具有季節性發病規律。初發與4月底,6月中上旬達到發病高峰,8月后會有個別相關性病例。不同人群的感染率有所不同,特別是林區工作人員,以及去林區旅游人員的感染率較高,這也跟媒介蜱的活動范圍有關[27,28]。
  
  伯氏疏螺旋體的傳播媒介主要為蜱,全世界發現的蜱種已經超過800種,目前我國發現的蜱種有100多種[29],其中有26種可感染或攜帶伯氏疏螺旋體[30]。北美洲地區萊姆病的主要傳播蜱種為太平洋硬蜱(I.pacificus)和肩突硬蜱(Ixodesscapularis)。歐洲地區則主要為全溝硬蜱(I. persulcatus)和篦子硬蜱(I.ricinus)[31,32],中國北方地區萊姆病傳播的蜱種為全溝硬蜱(I. persulcatus),南方地區則為二棘血蜱(Haemaphysalis bispinosa)、粒形硬蜱(I. granulatus)和長角血蜱(H.longicornis)[33]。我國研究人員在新疆地區采集到的亞洲璃眼蜱(Hyalommaasiaticum)、圖蘭扇頭蜱(Rhipicephalus  turanicus)、草原革蜱(Dermancentornuttalli)、邊緣革蜱(D. marginatus)和刻點血蜱(H. punctata)也已分離到伯氏疏螺旋體[34,35]。
  
  4、伯氏疏螺旋體感染與致病機制相關蛋白。
  
  萊姆病的生活史主要在媒介蜱跟宿主動物中,為了適應從媒介動物到宿主動物的不同環境,在傳播感染過程中,伯氏疏螺旋體通過基因的差異表達的調控機制用來逃避宿主免疫。蜱在叮咬宿主動物吸食血液的過程中,伯氏疏螺旋體下調表達的基因有Osp A、P22和P66,最主要有Osp C、Osp E、Osp F、Dbp A和Mlp8[36]。
  
  感染了伯氏疏螺旋體的蜱一旦吸食了血液,螺旋體會從中腸轉移到唾液腺,這期間Osp A表達量下調,同時Osp C表達量上調。當伯氏疏螺旋體從蜱中腸遷移到唾液腺時,Osp C基因表達量上調。當伯氏疏螺旋體進入蜱體內時,螺旋體上調表達的Osp A和Osp B蛋白能夠與蜱體內的TPOSPA結合,有利于維持螺旋體在蜱體內繁殖生存。唾液腺中的唾液蛋白Salp15與Osp C結合,從而保護伯氏疏螺旋體逃避天然免疫[37,38,39]。蜱在吸食血液時,BB0323基因會上調表達,該蛋白對病原體在蜱體內的維持也非常重要[40]。Vls E基因能夠編碼不同的Vls E蛋白,這可以保護螺旋體在不同的環境改變抗原,從而保護伯氏疏螺旋體逃避宿主免疫,對其在哺乳動物體內的感染及繁殖至關重要[41]。
  
  5、萊姆病臨床癥狀及病理變化。
  
  萊姆病是一種慢性傳染病,可以入侵人體多個器官組織,從而引起器官損傷。根據病程的發展,萊姆病可以分為3個時期,早期:局部性感染;中期:播散性感染;晚期:持續性感染[42]。
  
  1、人感染萊姆病的主要癥狀游走性紅斑(ECM)是本病最典型的病癥之一。蜱叮咬后,伯氏疏螺旋體隨唾液腺進入易感動物或人體內,幾天內叮咬部位會出現紅色的斑疹,隨后逐漸擴大,潛伏期通常為1-3周(典型的為7-10天)。該癥狀可出現于身體的任何部位,常見于大腿、腋下、腹股溝、耳部。中期播散型感染主要表現為神經系統的損傷,以顱神經損傷、面癱、腦膜炎和神經炎等癥狀。晚期持續性感染表現為關節炎,通常為關節腫脹和疼痛,其中膝關節癥狀尤為嚴重。研究表明,不同的基因型伯氏疏螺旋體會呈現出不同的致病性,且呈現不同的組織嗜性,B. afzelii主要表現為慢性皮炎[43]。B.  garinii常表現為淋巴細胞腦膜炎,顱神經炎等,主要與神經性的萊姆病相關[44],B. burgdorferi s.s的臨床癥狀主要表現為關節炎[45]。上述三種基因型均可表現為游走性紅斑的臨床癥狀。2、犬感染萊姆病的主要癥狀主要是由關節炎引起的跛行,厭食,發燒,嗜睡,淋巴結腫大以及腎小球腎炎[46,47]。
  
  6、萊姆病的診斷方法。
  
  隨著人們對萊姆病的深入研究,已經建立了一系列的有關萊姆病的診斷檢測方法。主要有:病原學檢測、核酸檢測及血清學檢測。
  
  1、病原學檢測。
  
  病原的直接檢測主要通過選取被感染的皮膚組織直接涂片染色后在光學顯微鏡下觀察,該方法對工作人員要求較高且需要有豐富的專業知識,同時該方法相較于其它檢測方法檢出率較低,因此臨床上較少應用病原直接檢測的方法。伯氏疏螺旋體通常用BSK-H液體培養基進行體外培養。將感染的組織研磨過濾接種于含有6%兔血清的BSK-H液體培養基中,放置于33℃的恒溫培養箱進行培養,每隔1天取樣暗視野顯微鏡下觀察,一般7-10天便可觀察到伯氏疏螺旋體[48]。實驗室通常將病原分離作為“金標準”,然而由于伯氏疏螺旋體生長較為緩慢,生長條件較為嚴格,培養基易污染等原因,所以病原的分離培養不常用于臨床診斷。
  
  2、血清學檢測。
  
  血清學檢測是目前臨床上最常用的檢測方法,現在用于萊姆病的血清學檢測方法有:間接免疫熒光(IFA)、免疫蛋白印跡試驗(Western blot)和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。IFA是最早用于該病的血清學診斷方法,其操作簡單易懂,但是容易出現假陽性。Western  blot檢測方法常用于檢測伯氏疏螺旋體的特異性蛋白組份抗體,雖然有良好的特異性,然而由于實驗條件的限制,臨床上很難大量使用[50,51,52]。目前在臨床診斷,特別是進行大規模的血清學流行病學調查時,ELISA就顯示出了操作方便,靈敏度高的優勢。目前針對于犬萊姆病的ELISA檢測方法國內尚未報道,這就急需科研人員開發出犬萊姆病的ELISA檢測診斷方法。
  
  3、分子生物學檢測。
  
  隨著分子生物學近幾年的飛速發展,基于核酸的分子生物學檢測方法也同樣用于萊姆病的臨床診斷。聚合酶鏈式反應(PCR)技術已經作為一種常用的檢測萊姆病的診斷技術。該方法常用的檢測靶基因主要包括16S r RNA、5S-23S r RNA、Fla A、Fla B等基因。在傳統的PCR技術上人們又建立了環介導等溫擴增技術(LAMP)和反向線性雜交(RLB)技術,從而更方便更準確的提供伯氏疏螺旋體的檢測結果[53,54]。
  
  7、本研究的目的意義。
  
  萊姆病在全球的分布較為廣泛,是一種重要的由媒介蜱傳播的人獸共患病。該病在我國分布廣泛,伯氏疏螺旋體的宿主動物種類繁多,給我國人民及寵物健康帶來嚴重危害。目前國內外針對萊姆病分子生物學檢測方法主要是PCR檢測方法,該方法較為快速,但是相對于熒光定量PCR檢測方法靈敏度較低。目前已經報道的有關萊姆病的熒光定量PCR檢測方法是探針法,其中探針價格昂貴且只能用于該段基因伯氏疏螺旋體的檢測,成本較染料法的高,為了能夠更廣泛的用于臨床診斷,本研究通過參考Gene Bank中已經發表的伯氏疏螺旋體的16Sr RNA為靶標序列設計引物,建立了伯氏疏螺旋體的SYBR  Green熒光定量檢測方法,對該方法進行了特異性和敏感性的評價,并對我國吉林省四平市采集的蜱樣本進行檢測。
  
  寵物犬與人們生活的關系越來越密切,目前IDEXX公司的SNAP 4DX檢測試紙已經在國內外運用多年,然而膠體金試紙條常常出現假陽性等問題。且該試紙條是基于VIs E蛋白所建立的檢查方法,A Rogovskyy于2012年研究結果表明VIs E蛋白存在抗原表位變異,因此該檢查方法存在漏檢、錯檢的可能。為了有效提高寵物細菌性傳染病的診斷與鑒別工作效率,本研究選用Osp C蛋白,該蛋白在蜱蟲叮咬犬支后,早期在犬體內大量表達,因此可極大提升所建方法的靈敏度。本研究利用原核表達系統,大量表達并進行純化Osp C蛋白,建立了相應的犬萊姆病的間接ELISA檢測方法。對該方法的特異性和敏感性進行了評估,發現本研究建立的間接ELISA檢測方法具有較高的敏感性和特異性,并對我國部分地區采集的犬血清進行了流行病學的調查。
  
  本研究主要分為以下幾部分,第一部分是基于16S r RNA基因片段,建立伯氏疏螺旋體的SYBR Green熒光定量檢測方法及初步驗證。第二部分對伯氏疏螺旋體的Osp C蛋白進行原核表達及免疫原性鑒定。第三部分是犬萊姆病的間接ELISA檢測方法的建立及應用。
  
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  第二篇 研究內容
  
  第1章 伯氏疏螺旋體SYBRGreenI熒光定量PCR方法的建立及驗證

  
  1.1、 材料.
  1.2、 方法.
  1.3、結 果.
  1.4、討論.
  1.5、 小結.
  
  第2章  伯氏疏螺旋體OspC的克隆表達及抗原性分析
  
  2.1、材料
  2.2、方法.
  2.2.1、蛋白的可溶性分析
  2.3、結果
  2.4、討論 .
  2.5、小結.
  
  第3章  犬萊姆病間接ELISA診斷方法的建立及應用
  
  3.1、材料.
  3.2、方法 .
  3.3、結果
  3.4、討論.
  3.5、小結.

  結  論

  1. 建立了伯氏疏螺旋體SYBR  Green  I熒光定量PCR方法,該方法的敏感性為常規PCR檢測方法的104倍。且與鉤端螺旋體、大腸桿菌、埃里希氏體和綠膿桿菌陽性樣品檢測結果均為陰性,說明該方法具有較高的特異性和敏感性,適用于伯氏疏螺旋體的檢測。

  2. 利用原核表達系統表達伯氏疏螺旋體Osp C蛋白,并進行Western-blot實驗驗證,結果表明該蛋白具有良好的免疫原性,并與本研究中所用到的其它病原犬陽性血清無交叉反應。應用Osp C蛋白建立了間接ELISA方法,當陽性閾值為16.02%,其特異性為96.00%(95%  CI  =86.3-99.5),敏感性為95.35%,適用于犬萊姆病抗體檢測。

  3. 應用建立的犬萊姆病間接ELISA方法,對來自北京、上海、江西、遼寧和吉林五個地區的309份犬血清樣品進行了犬萊姆病的抗體檢測,陽性率為20.71%,表明我國部分地區犬萊姆病的感染率較高。萊姆病作為一種人獸共患病,寵物犬萊姆病的及時診斷與防治對于獸醫公共衛生具有重要意義。

  參考文獻

    楊瑩瑩. 犬萊姆病診斷方法的建立及應用[D].吉林大學,2018.
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