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六價鉻中華田園犬心臟組織中毒模型構建分析

時間:2020-01-07 來源:山東農業大學 作者:陸建偉 本文字數:6935字
  中文摘要
  
  本試驗旨在建立六價鉻(Cr(VI))在中華田園犬心臟的中毒模型,試驗記錄并檢測35d以內的心電圖和3d內的心肌酶參數,病理組織學,炎性因子,氧化應激酶和ATP酶等指標的變化。為中華田園犬心臟組織的重金屬中毒機理的研究提供可靠的數據基礎。

六價鉻中華田園犬心臟組織中毒模型構建分析
  
  本試驗以重鉻酸鉀(K2Cr2O7)作為Cr(VI)的鉻源,對成年中華田園犬進行重鉻酸鉀(K2Cr2O7)攻毒,從而對其心臟組織的毒理作用進行研究;試驗分為對照組和低(L)、中(M)、高(H)劑量試驗組,對照組不添加重鉻酸鉀,試驗組的添加劑量由低到高分別為0.92mg/kg,1.15mg/kg,1.38mg/kg。通過使用三通道心電圖機標準肢導聯,記錄中華田園犬在俯臥位狀態下的相對靜態心電圖。攻毒前和攻毒后的72h內采用前肢皮下繞靜脈采取血液,離心取上清檢測心肌酶。35d后將中華田園犬進行安樂死,采取心臟組織進行病理組織學分析。利用勻漿機將心臟組織研磨,離心提取上清檢測心臟組織內炎性因子。檢測氧化應激酶,腺苷三磷酸酶(ATPase)的參數。試驗結果表明,35d試驗組的心電圖H組、M組和L組都表現出了I、II和III導聯明顯的ST段的上升,T波增高。a VF導聯H組表現出T波增高。導聯a VRL組、M量組和H量組T波和對照組相比出現高尖;心肌酶譜中,四種心肌酶谷草轉氨酶(AST),磷酸肌酸激酶(CK),磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脫氫酶(LDH)在攻毒后均發生顯著變化(P<0.05),試驗組中M組和H組的心肌酶含量隨時間的變化明顯上升(P<0.05);病理切片顯示僅H組有輕微病變,心肌細胞結構基本正常,細胞漿輕微疏松,排列比較整齊;氧化應激指標結果顯示,過氧化氫酶(CAT)和總超氧化物歧化酶(T-SOD)值隨Cr(VI)劑量的增加而下降,丙二醛(MDA)含量隨Cr(VI)劑量的增加而增加;炎性因子白細胞介素-1β(IL-1β),白細胞介素-8(IL-8)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)都有不同程度的升高,而IL-10含量卻隨著Cr(VI)劑量的增加而下降 ;腺苷三磷酸酶(ATPase)的含量也隨著Cr(VI)劑量的增加而下降。
  
  結論:本試驗成功建立六價鉻中華田園犬心臟組織中毒模型,檢測了試驗犬心電圖、心肌酶參數、病理組織學、炎性因子、氧化應激酶和ATPase等指標的變化。其結果表明不同濃度的Cr(VI)對中環田園犬的心臟造成不同程度的損傷,并且Cr(VI)進入中華田園犬機體內可引起心臟的氧化損傷,炎癥反應和ATPase含量的改變。
  
  關鍵詞:  中華田園犬;Cr(VI);心電圖;ATPase;炎性因子。
  
  Abstract
  
  This experiment aims to establish a poisoning model of hexavalent chromium (Cr(VI)) in heart of Chinese rural dog. The test records and detects the electrocardiogram within 35d and the myocardial enzyme parameters within 3d. Histopathology, inflammatory factors, oxidation should be changes in indicators such as kinases and ATPase. It provides a reliable data foundation for the study of the mechanism of heavy metal poisoning in Chinese rural dog heart tissue.
  
  In this experiment, potassium dichromate (K2Cr2O7) was used as the chromium source of Cr(VI), and the adult Chinese dog was challenged with potassium dichromate (K2Cr2O7) tostudy the toxicological effects of its heart tissue. In the control group and the low (L), medium (M), and high (H) dose test groups, the control group did not add potassium dichromate. The additive amount of the test group was 0.92 mg/kg, 1.15 mg/kg and 1.38mg/kg. The relative static electrocardiogram of the Chinese rural dog in the prone position was recorded by using a three-channel electrocardiograph standard limb lead. Before the challenge and within 72h after the challenge, the blood was taken from the forearm subcutaneous vein, and the supernatant was centrifuged to detect the myocardial enzyme. The Chinese rural dog was euthanized 35d later, and histological analysis was performed using cardiac tissue. The heart tissue was ground using a homogenizer, and the supernatant was centrifuged to detect inflammatory factors in the heart tissue. The parameters of oxidative kinase, adenosine triphosphatase (ATPase) were measured. The results of the test showed that the electrocardiograms of group H, group M and group L of the 35d test group showed significant ST segment elevation and increased T wave in leads of I, II and III. The H group of the a VF lead showed an increase in T wave. The lead waves of the a VRL group, the M group, and the H group were higher than those of the control group. In the myocardial enzyme spectrum,four myocardial enzymes, aspartate aminotransferase (AST), phosphocreatine kinase (CK),and phosphocreatine kinase were co-workers. Enzyme (CK-MB) and lactate dehydrogenase (LDH) showed significant changes after challenge (P<0.05). The myocardial enzyme content of M group and H group increased significantly with time in the experimental group (P<0.05).Pathological sections showed only mild lesions in group H, myocardial cell structure was basically normal, cytoplasm was slightly loose, and the arrangement was relatively neat.Oxidative stress index showed that catalase (CAT) and total superoxide dismutase (T-SOD)decreased with increasing Cr(VI) dose, and malondialdehyde (MDA) content increased withincreasing Cr(VI) dose. Inflammatory factor interleukin-1β (IL-1β), interleukin Both -8 (IL-8)and tumor necrosis factor-α (TNF-α) increased to varying degrees, while IL-10 content decreased with increasing dose of Cr(VI). Adenosine triphosphatase ( The content of ATPase) also decreased with increasing Cr(VI) dose.
  
  Conclusion: This experiment successfully established a hexavalent chromium Chinese rural dog heart tissue poisoning model, and tested the changes of electrocardiogram,myocardial enzyme parameters, histopathology, inflammatory factors, oxidative kinase and ATPase. The results showed that different concentrations of Cr(VI) caused different degrees of damage to the heart of the Chinese rural dog, and Cr(VI) could cause oxidative damage,inflammation and ATPase content in the Chinese rural dog.
  
  Key words:    Chinese rural dog; Cr(VI); ECG; ATPase; Inflammatory factor。
  
  1、引言。
  
  1.1、中華田園犬的介紹。

  
  中華田園犬(拉丁學名:Canis lupus familiaris),傳統稱呼為“土狗”,北方有的地方又叫“柴狗”,屬于食肉目、犬科、犬亞科的一種哺乳動物,長大后肩高約25-55厘米,體重約10-30公斤。中華田園犬與中國狼、草原狼外形非常相似,嘴短,額平。中國土狗主要分布于長城以南、青藏高原以東,以中部地區為中心的低海拔的漢族集聚區域,廣泛存在于中國漢族農村及東南亞地區,現在城市化發展飛快,人們廣泛把中華田園犬當作寵物狗飼養。中華田園犬是中國漢族幾千年農耕社會背景下的產物,被稱為“中華國犬”(李揚,2018 )。
  
  1.1.0、中華田園犬的歷史。
  

  秦始皇一統中原時有個歷史典故:秦朝丞相李斯臨刑悲傷的說:“吾欲與若復牽黃犬俱出,上蔡,東門逐狡兔,豈可得乎”。這里的“黃”指的就是這種用于行獵的田園犬。在現代漢族民間人們稱之為“土狗”,顧名思義就是本土本地區的狗;北方有的地方又叫“柴狗”,因為北方氣候寒冷,狗一般都會窩在柴灶或柴堆旁;東方江浙滬地區則一般被稱為“草狗”,這里的“草”就是“土”、本地產的意思。當地的農民家中都會養一兩條這樣的狗看家作伴。土狗的定義是指某地域的特產犬種,適合當地的氣候特點,比其他種類犬更容易獨立生存。
  
  中國土狗大多生存于中國農村、郊外,多為放養型且在原生犬種中占多數比例。部分學者認為中華田園犬與日本柴犬在遺傳上的確存在聯系,很可能是由同一犬類祖先進化而來的。但由于地理環境和氣候等原因所以產生不同的性狀特征,F今絕大部分犬類的歷史發源地都被證明是中國或者說的古代的中國。由中科院院士張亞平帶領的研究小組完成的論文《走出東亞南部:全世界家犬的起源歷史》中研究稱:包括吉娃娃、松獅等在內的全世界的家犬,都起源于中國南方等東亞南部地區,自灰狼進化而來(丁昭莉.2009)。東亞南部地區的家犬的基因組擁有全世界最豐富的遺傳多樣性。
  
  1.1.1、形態特征。
  
  不同地區之間的中國土狗有大小、形態的差異,但它們之間都有一定共同的特點。有些地方之間的差異比較大,這是由于自由繁殖遺傳的不穩定性,所以不同地方的土狗就產生許多各自的特色。下面總結出的是部分土狗的外貌特征:
  
  頭部:頭部特征更加接近于其祖先灰狼的外貌,嘴尖,嘴短,額平。
  
  耳朵:耳位高,耳小且直立或半直立,半直立的耳朵下垂方向是向犬的頭部正前方半下垂。(不同于其它一些犬種耳朵大且耳朵向頭部兩邊全塌下去)尾巴:尾巴向上翹起,特別在行走時會高高翹起,以金錢尾和鐮刀尾為主。
  
  后腿:當站立靜止時,后腿明顯很平直并垂直于地面,踝關節彎曲不明顯。
  
  毛:棕毛為主,毛質粗,容易保持干凈。顏色黃、白、黑、雜色都有。
  
  體形:身體勻稱而緊湊;中等大小,身長與肩高比約成1:1,加上后腿平直并幾乎垂直于地面使整個身體成正方形。
  
  柴犬近親:中型犬,跟柴犬相似,黃色外體,白色臉部,耳朵豎起,適合純種狗配種生育后代。
  
  1.1.2、生活習性。
  
  中華田園犬性格溫順,比較容易飼養,忠誠度特別高;適應群居生活,地域性比較強,幾乎不生皮膚病。在大部分農村地區被用于看家以及早期的狩獵幫手。
  
  1.1.3、取食習性。
  
  中華田園犬是肉食動物,因此在喂養時,在狗料配制中要有較多的動物蛋白(肉食),輔助以少量的素食,這樣才能保證中華田園犬生長發育和機體所需的營養健康。中華田園犬有的時候也會吃少量的草,偶爾也吐掉,吃草并不是因為缺少食物,而是為了清胃。
  
  犬類的腸胃結構比較獨特。犬類的胃相對比較大,約占腹腔體積的2/3,但是腸結構卻相對小,約占腹腔體積的1/3,所以犬類基本上是利用胃部來消化和吸收,容易消化動物類蛋白,不易消化像植物的莖,葉等植物性蛋白。
  
  中國田園犬也與其他犬類一樣有食糞的習性,就是以人類和自身的糞便為食物的習性。研究表明,在近萬年的馴化進程中犬類與人類的相處而養成的一種習性,這是古代食物匱乏時期犬類被動接受糞便作為食物的原因之一。另有一些人認為這是狗在食物缺乏、營養不良或者患某種慢性病期間的一種病態表現。
  
  1.1.4、行為習性。
  
  等級制度:中華田園犬在群居時,有一定等級制度。建立這樣的等級制度可以保持整個群體的穩定,減少由食物分配、生存空間和異性選擇而引起的“戰爭”。
  
  睡前轉圈:臥下前,中華田園犬總在周圍轉一轉,確定沒有危險之后,才放心入眠。
  
  喜歡被撫摸:中華田園犬的肚皮、背部和脖頸部喜歡被輕輕地撫摸。
  
  對陌生人的態度:中華田園犬的行為準則是根據視線的高度來判斷對手的是否充滿危險和敵意。
  
  露肚皮:中華田園犬讓人家看它的肚皮是向對方表示順從、認錯和撒嬌。犬類從不攻擊倒下露出肚皮的其他犬類。
  
  搖尾巴:中華田園犬的搖尾巴是一種溝通的形式。
  
  避開群體:如果中華田園犬生病時,會刻意地避開主人或者其他的同類,躲在陰暗處去康復或死亡。
  
  撒尿標記:中華田園犬利用尿液標記“領地、吸引異性、或做路標”。從狼演化的犬類也遺傳著祖先這種習性。
  
  領地意識:中華田園犬具有領地習性,占有并加以保護自己的領地,禁止其他動物侵入。它們利用具有特殊氣味的糞便、汗液和在地上抓畫等方法,以此為記號來標記領地。
  
  1.1.5、分布范圍。
  
  1.1.5.1、總體分布。

  
  中國田園犬主要分布于長城以南,青藏高原以東,以中原為中心的廣大地域(董淑慧.2017),在這個區域里環境溫暖,比較適宜生存繁衍,這樣的地域分布清楚地明確了中華田園犬的生存環境是低海拔農耕社會地區。當然隨著中華民族幾千年來的不斷遷徙,使中華田園犬的分布范圍也在不斷擴大。比如中國東北,由于漢族的分布擴散,那里農村也有很多不同于東北牧區的中華田園犬,也有一部分與其它地區的狗種雜交形成了新的犬品種。但可以肯定中華田園犬是中國中原地區農耕社會的產物。
  
  1.1.5.2、亞種分布。
  
  中華田園犬廣泛分布于中國漢族農村,由于地域、環境和血緣等關系的因素形成了很多不同的品系、亞種。從犬的外型特點和分布區域進行分析,中國土狗大致可分為三大品系,分別是北方品系、江浙品系、兩廣品系。注:三大品系是從宏觀上分析得出的結果,在很多小的地方肯定還有一些獨特的亞中華田園犬種出現。在這三大品系分布區之間還存在很大一部分品系的邊渡地帶,這里的狗也呈過渡品種出現。三大品系的分布地帶呈一個三角形,中間有一塊較大的空白區域以湖北湖南為主,這一地區的中華田園犬是否是獨立品系還是過渡品種有待進一步的研究論證。
  
  1.1.6、繁殖方式。
  
  中國土狗全年可以繁殖,高峰期為雨季的后半期,即每年的3月到6月間和9月到11月間繁殖。孕期約為60d左右,每胎產通常為4仔左右。生殖間歇期為6-8月,斷奶期為10周左右。一般40d后,小狗就會開始外出活動,6-8個月達到性成熟。
  
  1.2、鉻的介紹。
  
  近些年來,隨著我國的重工業不斷發展,工業污染尤其重金屬污染愈發嚴重,給自然環境和居民生活造成了極大的危害。鉻鹽是重要的無機化合物之一,廣泛應用于電鍍、印染、皮革等行業生產制造中得到大力的應用(Cervantes, 2001),但鉻及其化合物的排放也對環境造成重金屬的污染。目前有關鉻排放物所造成的重金屬污染的報道已經越來越多,比如長期接觸鉻化合物的工人內臟組織器官或皮膚發生癌癥和損傷(Quievryn et al.,2006)。雖然鉻常見化合價為正二價、正三價和正六價,但是自然環境中只有三價鉻(Cr(Ⅲ))和六價鉻(Cr(VI))形態具有穩定性。Cr(Ⅲ)毒性較低,很難進入細胞內(井明艷,2005)。Cr(VI)作為一種強氧化劑,很容易進入細胞內部破壞細胞的結構,致使機體造成損傷。許多的研究表明,Cr(VI)對生物的機體具有致畸變、致突變作用(Svecevi?, 2006; Xieet al., 2005;陳瓊宇,2000)。因此Cr(VI)被認為是一種具有很強毒力的致癌物質。
  
  1.2.1、鉻的理化特性。
  
  鉻是一種銀白色且硬脆性金屬,純鉻有延展性。固態密度為7.20g/cm3,液態密度為6.9g/cm3,熔點是1857±20℃,沸點是2672℃。鉻可溶于強堿溶液,具有很高的耐腐蝕性,在空氣中氧化很慢;瘜W元素周期表中屬第一過渡系的VIB族,原子序數是24,元素原子質量59.996。在自然界中,鉻從零價到正六價呈現多種價態,但Cr(III)和Cr(VI)的結構比較穩定,因此一般都是以Cr(III)和Cr(VI)形式存在。在自然界中鉻元素在土壤、大氣、水和動植物體內廣泛的分布。地殼中鉻的含量大約在200mgkg-1左右,約占地殼總量的0.02%。在鉻的多種價態中,鉻的氧化性強弱與鉻價態有很大的關系,其中二價鉻在空氣中極不穩定,會氧化形成Cr(VI)從而形成鉻酸鹽和重鉻酸鹽(OnderciMet al., 2003)(劉顯軍等,2004)。在無機鉻中常見的形態為正三價和正六價,而Cr(VI)的毒性比Cr(Ⅲ)大100-1000倍(李艷廷等,2000),因此Cr(VI)化合物是鉻毒性研究的主要對象。
  
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  1.2.2、 在機體內的鉻.
  1.2.2.1 、機體內鉻的吸收
  1.2.2.2 、機體內鉻的代謝
  1.2.2.3、鉻的生物學機制
  1.2.2.4 、鉻對臟器的作用
  1.2.2.4.1 、鉻對肝臟的作用
  1.2.2.4.2 、鉻對腎臟的作用
  1.2.2.4.3 、鉻對肺臟的作用
  1.2.2.4.4、鉻對機體抗氧化能力的影響
  
  1.3、對本試驗檢測指標的介紹
  1.3.1、 心電圖
  1.3.2、心肌酶
  1.3.3、 抗氧化指標
  1.3.4 、炎性指標
  1.3.5 、ATPase
  
  1.4、研究目的和意義
  
  2、材料與方法
  
  2.1、試劑和儀器

  2.1.1 、試劑.
  2.1.2、儀器
  
  2.2、試驗分組
  
  2.3、心電圖檢測
  
  2.4、心肌酶檢測.
  
  2.5、心臟組織病理切片的制作.
  
  2.6、組織勻漿的制備.
  
  2.7、氧化應激的檢測

  2.7.1、心臟組織蛋白含量的測定.
  2.7.2、心臟組織過氧化氫酶(CAT)的測定.
  2.7.3、心臟組織丙二醛(MDA)的測定
  2.7.4、心臟組織超氧化物歧化酶(T-SOD)活性的測定.
  
  2.8、心臟組織的炎性因子
  
  2.9 、ATPase的檢測
  
  2.10、統計分析
  
  3、結果

  
  3.1、 一般觀察
  3.2、心電圖指標
  3.3、心肌酶
  3.4、病理組學觀察
  3.5、氧化應激.
  3.6、炎性因子
  3.7 、ATPase的活性
  
  4、討論
  
  4.1、 心電圖
  4.2、心肌酶
  4.3、病理切片
  4.4、氧化應激
  4.5、 炎性因子
  4.6、 ATPase

  5  結論

  本試驗成功建立Cr(VI)在中華田園犬的心臟組織的中毒模型,研究了重金屬中毒模型建成后35d內心電圖異常變化和3d內心肌酶變化,以及心臟組織病理組織學觀察,氧化應激酶,炎性因子和ATP酶的變化,其中心電圖的ST段和T波,CK-MB,AST,CK,LDH,CAT,T-AOC,MDA,IL-1β,IL-8,TNF-α,IL-10,Na+-K+-ATPase,和Ca2+-Mg2+-ATPase試驗組與對照組有顯著性差異。不同劑量的Cr(VI)對中華田園犬心臟造成不同程度的損傷,并且Cr(VI)進入中華田園犬體內可引起心臟的氧化損傷和ATPase含量的改變。初步確立了Cr(VI)對中華田園犬心臟毒理作用的相關指標變化,為研究中華田園犬重金屬中毒提供一定的理論基礎。

  參考文獻

    陸建偉. 六價鉻對中華田園犬心臟的毒理作用研究[D].山東農業大學,2019.
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